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  • 蛋白質多肽檢測

    ·蛋白質檢測概述
    蛋白質譜技術簡單來說就是一種將質譜儀用于研究蛋白質的技術。目前,它的基本原理是蛋白質經過蛋白酶的酶切消化后成肽段混合物,在質譜儀中肽段混合物電離形成帶電離子,質譜分析器的電場、磁場將具有特定質量與電荷比值(即質荷比,M/Z)的肽段離子分離開來,經過檢測器收集分離的離子,確定每個離子的M/Z值。經過質量分析器可分析出每個肽段的M/Z,得到蛋白質所有肽段的M/Z圖譜,即蛋白質的一級質譜峰圖。離子選擇裝置自動選取強度較大肽段離子進行二級質譜分析,輸出選取肽段的二級質譜峰圖,通過和理論上蛋白質經過胰蛋白酶消化后產生的一級質譜峰圖和二級質譜峰圖進行比對而鑒定蛋白質。

    一開始,蛋白質譜通過離子化(Electrospray Ionization,ESI)或者基質輔助激光解吸電離(Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization,MALDI)的方法對完整的蛋白質進行離子化后進入質譜分析儀器,這也被稱為“top-down”蛋白分析方法。后來,完整的蛋白質通過酶切作用后,分解成多肽混合物,這些混合物進入質譜儀后,通過多肽指紋圖譜或串聯質譜的方法進行鑒定,這被稱為"bottom-up"方法。顯然,后者可以從多肽水平實現對蛋白質的分析和鑒定。

    蛋白質檢測的其他方法

    1、凱氏定氮法

    這種方法是1883年Kjeldahl發明,當時凱氏只使用H2SO4來分解試樣,來定量谷物中的pro,他只知用H2SO4分解試樣,而不能闡明H2SO4分解有機氮化合物生成氨的反應歷程,所以只使用H2SO4分解試樣,需要較長時間,后來由Gunning加入改進,他改進的辦法是在消化時加入K2SO4使沸點上升,這樣加快分解速度,因為溫度由原來硫酸沸點的380上升到400℃,提高了不到67℃所以速度也就加快了,凱氏定氮法至今仍在使用。我們在檢驗食品中pro時,往往只限于測定總氮量,然后乘以pro核算等數,得到蛋白質含量,實際上包括核酸、生物堿、含氮類脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質氮化合物,故稱為粗pro。

    2、
    水揚酸比色法

    原理: 樣品中的pro經H2SO4消化轉化為銨鹽溶液后,在一定的酸度和溫度下與水揚酸鈉和次氯酸鈉作用生成有顏色的化合物,可以在波長660nm處比色測定,求出樣品含氮量,計算蛋白質含量。

    3、紫外分光光度法

    原理:pro及其降解產物的芳香環基 ,在紫外區內對某一波長具有一定的光選擇吸收,在280nm下,光吸收與pro濃度(3~8mg/ml)成直線關系,因此,通過測定pro溶液的吸光度,并參照事先用K氏定氮法分析的標準樣品,從標準曲線查出蛋白質的含量。

    4、雙縮脲法-皮尼克法

    原理:雙縮脲在堿性條件中,能與CuSO4結合成紅紫色的絡合物。pro分子中含有肽鏈與雙縮脲結構相似,也呈此反應。本法直接用于測定像小麥粉等固體試樣的pro含量。但作為銅的穩定劑,酒石酸鉀鈉比甘油好些。小麥粉中的pro能直接地一邊抽出一邊進行定量。

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